Introduzione
Il contenuto proteico è un parametro critico negli alimenti per l’uomo, negli alimenti per animali da compagnia e nei mangimi, poiché influenza l’etichettatura nutrizionale, la selezione degli ingredienti e le decisioni di processo.
Uno dei test fondamentali è la determinazione del contenuto proteico degli alimenti. La determinazione accurata della quantità di proteine, attraverso la misurazione del contenuto di azoto, è essenziale per definire le caratteristiche nutrizionali dei mangimi e per garantire la sicurezza dei prodotti alimentari finali destinati al consumo umano e animale.
Metodi disponibili per l’analisi di azoto/proteine
Esistono diverse tecniche analitiche per determinare il contenuto di proteine/azoto:
❖ NIR (riflettanza nel vicino infrarosso)
❖ Metodo Kjeldahl (chimica umida)
❖ Metodo Dumas (basato sulla combustione)
Sebbene le tecniche spettroscopiche come la riflettanza nel vicino infrarosso (NIR) possano stimare il contenuto proteico e di altri costituenti, si tratta di metodi secondari che richiedono un’ampia calibrazione e sono altamente sensibili alle variazioni della matrice.
La determinazione quantitativa primaria delle proteine si basa tradizionalmente sulla misurazione dell’azoto tramite il metodo Kjeldahl (chimica umida) o il metodo Dumas (combustione), con calcolo del contenuto proteico attraverso fattori di conversione azoto-proteina che variano in base al tipo di materiale.
Metodo Kjeldahl
Per oltre un secolo, il metodo Kjeldahl è stato il metodo più utilizzato e lo standard industriale per la determinazione del contenuto proteico totale negli alimenti, tramite la misurazione dell’azoto organico totale.
Il metodo Kjeldahl fu originariamente progettato per l’industria birraria, per monitorare le variazioni proteiche nei cereali durante la germinazione e la fermentazione (Kjeldahl, 1883; Bradstreet, 1954). Pubblicato per la prima volta nel 1883, il metodo è stato accettato, con modifiche, come standard per la determinazione del contenuto di azoto.
Nel corso degli ultimi 100 anni il metodo e le apparecchiature Kjeldahl sono stati significativamente modificati, ma i principi di base rimangono invariati e comprendono tre fasi principali:
- Digestione – decomposizione dell’azoto presente nei campioni organici mediante ebollizione in acido solforico concentrato, con formazione di una soluzione di solfato di ammonio.
- Distillazione – aggiunta di una base in eccesso alla miscela digerita acida, che converte lo ione ammonio (NH₄⁺) in ammoniaca (NH₃), seguita da ebollizione e condensazione del gas NH₃ in una soluzione di raccolta.
- Titolazione – quantificazione dell’ammoniaca presente nella soluzione di raccolta.
Sebbene oggi siano disponibili sistemi Kjeldahl semi-automatici o automatici, le varie fasi del processo comportano ancora procedure laboriose che potrebbero non essere pienamente conformi alle più recenti normative di sicurezza, a causa dell’impiego di sostanze potenzialmente pericolose come acido solforico e idrossido di sodio.
Trattandosi di un’analisi basata su chimica umida, richiede tempi lunghi ed elevati costi di manodopera. Oggi questo rappresenta un aspetto critico sia dal punto di vista della sicurezza sia da quello economico.
Metodo Dumas
Il metodo Dumas è considerato un metodo diretto per la determinazione del contenuto totale di azoto. Fu sviluppato nel 1831 da Dumas, dall’osservazione che i composti azotati riscaldati con alcali producono ammoniaca, determinabile volumetricamente.
Attualmente, il metodo consiste nella combustione di un campione di massa nota in una camera ad alta temperatura (800–900 °C) in presenza di ossigeno, producendo anidride carbonica (CO₂), acqua e azoto. I gas vengono quindi fatti passare attraverso colonne specifiche che assorbono CO₂ e acqua.
Una colonna contenente un rivelatore a conducibilità termica consente poi di separare l’azoto dai residui di CO₂ e acqua, e di misurarne il contenuto. Lo strumento deve essere inizialmente calibrato analizzando un materiale puro con concentrazione nota di azoto.
Il segnale misurato dal rivelatore a conducibilità termica per il campione incognito viene convertito in contenuto di azoto.
I sistemi Dumas sono quindi semplici da utilizzare, rapidi e non richiedono l’impiego di reagenti chimici potenzialmente pericolosi.
Confronto tra metodo Kjeldahl e metodo Dumas
Poiché il metodo Dumas determina l’azoto totale, includendo anche le frazioni inorganiche come nitriti e nitrati, mentre il metodo Kjeldahl determina solo l’azoto organico e l’ammoniaca, negli studi comparativi sono emerse differenze nei risultati.
Il metodo Kjeldahl non recupera tutto l’azoto organico e presenta difficoltà soprattutto nel recupero di composti azotati eterociclici, come ad esempio l’acido nicotinico. Questo non è stato considerato un problema rilevante nelle determinazioni di proteina grezza, poiché l’aspetto principale era la conversione dell’azoto α-amminico degli amminoacidi in ammoniaca.
Storicamente, i fattori di conversione azoto-proteina per il metodo Kjeldahl tradizionale sono stati stabiliti in base al profilo aminoacidico del campione. Per mangimi e alimenti con composizione variabile, è stato concordato un fattore generale pari a 6,25. Quando si utilizzano gli stessi fattori di conversione per tecniche con recuperi di azoto differenti, possono verificarsi differenze nei risultati.
Secondo la norma ISO/TS 16634-2:2009, il fattore di conversione generalmente accettato è pari a 5,7 per grano, segale e loro derivati macinati, e 6,25 per tutti gli altri prodotti rientranti nel campo di applicazione della norma.
I metodi Dumas e Kjeldahl possono quindi fornire risultati diversi, a seconda del contenuto di azoto non proteico nel campione analizzato e del grado con cui tale azoto viene recuperato dai rispettivi metodi.
L’AAFCO (American Association of Feed Control Officials) PTS è uno dei programmi di prove valutative interlaboratorio più completi, con circa 300 laboratori partecipanti e oltre 100 metodi riportati. Per il Kjeldahl sono stati selezionati i valori del metodo di riferimento AOAC 2001.11. Come osservabile, le deviazioni standard dei risultati riportati (indicate tra parentesi) sono comparabili, ma il metodo Dumas tende a fornire valori più elevati.
Nel corso di cinque annate agrarie (2000–2004), il Max Rubner Institute di Detmold (Germania) ha condotto uno studio approfondito su oltre 800 campioni di frumento confrontando i risultati di proteina grezza ottenuti con i metodi Kjeldahl e Dumas.
È emerso che circa il 2% della “proteina Dumas” non veniva determinato con il metodo Kjeldahl ed è stata proposta la seguente relazione tra i valori proteici ottenuti con i due metodi:
Kjeldahl = 0,959*Dumas + 0,258
Poiché la differenza tra i metodi non dipende solo dall’anno di coltivazione e dalla cultivar, ma anche dalle condizioni di crescita (ad es. pioggia, fertilizzazione), questa formula non può essere utilizzata in modo generale per convertire i risultati.
Numerosi altri studi comparativi sono stati riportati in letteratura. Alcuni di essi concludono che il metodo Dumas può sostituire il metodo Kjeldahl per la determinazione della proteina grezza in specifici gruppi alimentari, quando vengono utilizzati coefficienti appropriati.
Sono stati suggeriti i seguenti fattori di correzione per il calcolo della proteina grezza a partire dai risultati ottenuti con il metodo Dumas:
- 1,01 per i latticini
- 1,00 per i semi oleosi
- 0,99 per i mangimi
- 0,98 per le formule per lattanti
- 0,95 per i cereali
- 0,94 per le carni
- 0,89 per le verdure
- 0,80 per il pesce
- 0,73 per la frutta
Dopo diversi studi comparativi, oggi esistono varie norme internazionali che prevedono l’utilizzo del metodo Dumas come alternativa al metodo Kjeldahl.
Vantaggi del metodo Dumas
❖ Produttività dei campioni
Il tempo di analisi per il metodo Kjeldahl è di almeno 100 minuti. Utilizzando il metodo a lotti (batch), è possibile analizzare fino a un massimo di 100 campioni al giorno, ma il tempo necessario per un singolo campione è lo stesso richiesto per l’intero lotto. Il metodo risulta quindi lungo e ad alta intensità di manodopera, a causa delle numerose fasi manuali di preparazione e trattamento del campione.
Con il metodo Dumas per la determinazione dell’azoto, il tempo di analisi per campione è di circa quattro-cinque minuti; i risultati (anche per singoli campioni) sono quindi disponibili molto più rapidamente rispetto al metodo Kjeldahl.
❖ Costo per analisi
Il costo per analisi con il metodo Kjeldahl è di circa 6 €*. I principali fattori di costo sono rappresentati dai reagenti chimici, dal loro corretto smaltimento e dai costi del personale. Inoltre, è necessario disporre di una cappa aspirante, generalmente costosa e con spazio limitato.
In confronto, il costo per analisi con il metodo Dumas è di circa 0,49 €, a seconda dell’analizzatore e del gas di trasporto utilizzato (i costi possono variare in base al Paese).
❖ Sostenibilità ambientale
La determinazione dell’azoto secondo Kjeldahl utilizza acido solforico concentrato e catalizzatori potenzialmente pericolosi per l’operatore e per l’ambiente. Inoltre, i rifiuti liquidi prodotti durante il processo analitico sono dannosi per l’ambiente e richiedono uno smaltimento costoso.
Il metodo Dumas, invece, non richiede l’impiego di sostanze chimiche nocive o tossiche.
